Próbki biologiczne oraz rozbijanie komórek

OD ROZBIJANIA KOMÓREK PO HOMOGENIZACJĘ I PROSZKOWANIE RÓŻNORODNYCH MATERIAŁÓW BIOLOGICZNYCH

Przygotowanie próbek biologicznych, takich jak kości, rośliny, mięśnie lub plwocina do analizy DNA, RNA, białek lub metabolitów może być prawdziwym wyzwaniem. RETSCH oferuje młyny laboratoryjne i homogenizatory, które proszkują i homogenizują próbki stałe, ale nadają się również do rozbijania komórek. Młyny RETSCH są wykorzystywane w takich dziedzinach jak biotechnologia, diagnostyka, kryminalistyka, rolnictwo i mikrobiologia.

Rozbijanie komórek mikroorganizmów (w zawiesinie)

Rozbijanie komórek jest często wybieraną metodą ekstrakcji składników komórkowych z bakterii, drożdży, grzybów lub mikroalg i jest przeprowadzane chemicznie lub mechanicznie. Metody mechaniczne nadają się lepiej do komórek o twardych ścianach lub gdy niewskazane jest stosowanie związków chemiczne ze względu na ich wpływ na ekstrakcję. Powszechną i skuteczną metodą jest rozbijanie za pomocą kulek - najczęściej w zawiesinie. Ta metoda może być wykonywane na małą lub dużą skalę, przy użyciu różnych typów fiolek i probówek. Jednym ze sposobów jest wymieszanie zawiesiny z kulkami i użycie mieszadła typu vortex. Procedura ta jest jednak powolna i niespójna, szczególnie w przypadku dużej liczby próbek lub długich procesów. Lepszym sposobem jest użycie młynów miksujących RETSCH z adapterami, które automatyzują proces, czyniąc go szybkim, wydajnym i powtarzalnym.

Kliknij by obejrzeć film

Młyn miksujący MM 400 - Rozbijanie komórek drożdży*

_{*Na filmie pokazano poprzedni model o identycznej zasadzie działania.}

^{Zwiększona powtarzalność całkowitego stężenia białka po rozbiciu komórek, 7 min w
MM 400, 12 min Vortex.
Słupki błędów: % odchylenie standardowe}

MM 400 przetwarza do 20 próbek w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 lub 2 ml bez zanieczyszczeń krzyżowych, co oszczędza czas operatora. Dodatkowo dostępny jest adapter umożliwiający umieszczenie do ośmiu probówek typu Falcon o pojemności 50 ml. Optymalny rozmiar kulek do rozbijania komórek różni się w zależności od rodzaju komórek; w przypadku bakterii i drożdży zalecane są szklane kulki o wielkości od 0,75 do 1,5 mm, podczas gdy mniejsze kulki w zakresie od 0,1 do 0,5 mm są bardziej odpowiednie dla grzybów i mikroalg. Do ekstrakcji DNA lub RNA idealne są mniejsze probówki jednorazowego użytku o pojemności do 2 ml, podczas gdy większe fiolki, takie jak probówki Falcon o pojemności 50 ml, dobrze nadają się do przetwarzania białek lub metabolitów. Optymalne parametry procesu mielenia różnią się w zależności od typu komórek. Znalezienie najlepszych wyników może wymagać kilku eksperymentów. Zazwyczaj do pełnego rozbicia komórek wymagane jest od 30 sekund (większość mikroalg) do 7 min (ogólnie drożdże) rozbijania w młynie kulowym. Młyn miksujący MM 500 vario obsługuje do pięćdziesięciu jednorazowych probówek 2 ml, co znacznie zwiększa przepustowość i wydajność.

Komórki Phaeodactylum tricornutum przed (po lewej) i po rozbiciu (po prawej) za pomocą młynka miksującego MM 400 wyposażonego w adapter do probówek Falcon.

Temperature control for bead beating in cell suspension

Temperatura odgrywa kluczową rolę, szczególnie wtedy, gdy mamy do czynienia z wrażliwymi na nią białkami. Jednym z rozwiązań jest mielenie kriogeniczne (patrz odpowiednia sekcja), a drugim chłodzenie zawiesiny komórek. W przypadku MM 400 wzrost temperatury w probówkach o pojemności 2 ml jest umiarkowany nawet przy prędkości 30 Hz. Prostym sposobem jest także wprowadzenie przerw w procesie mielenia po czasie >1 min i schłodzenie w łaźni lodowej adaptera z probówkami przez jedną minutę. W ten sposób w zależności od rozmiaru użytych kulek temperatura utrzymuje się poniżej 12-15°C.

^{Wzrost temperatury podczas rozbijania komórek w MM 400 przy 30 Hz lub za pomocą wirówki Vortex, chłodzenie na lodzie po każdej minucie rozbijania komórek.}

Sposobem na kontrolowanie rozwoju temperatury podczas rozbijania za pomocą kul jest użycie Młyna Miksującego MM 500 control. Specjalny adapter mieści osiemnaście jednorazowych fiolek o pojemności 2 ml. Urządzenie jest podłączone do agregatu chłodzącego z wodą o temperaturze 4°C, która z kolei chłodzi adapter i znajdujące się w nim fiolki. W ten sposób temperatura zawiesiny jest utrzymywana na poziomie około 13°C, ale bez niewygodnych faz ręcznego przerywania procesu i chłodzenia w łaźni lodowej. Co prawda MM 500 control nie obsługuje probówek typu Falcon, ale może być używany z naczyniami do mielenia ze stali nierdzewnej o pojemności 50, 80 lub 125 ml (patrz przykład po lewej: P. pastoris).

Jeśli młynek jest używany z ciekłym azotem oraz przystawką CryoPad i ustawiony jest na temperaturę 0°C, temperatura zawiesiny komórek w 2 ml probówkach jednorazowego użytku może być utrzymywana na poziomie 0°C, a przy tym bez zamrażania zawiesiny, dzięki czemu nadal możliwe jest skuteczne rozbijanie za pomocą poruszających się w niej kul.

Homogenizacja miękkich i twardych próbek pochodzenia biologicznego

Niektóre próbki biologiczne, takie jak plwocina od pacjentów z mukowiscydozą lub próbki tkanek, takie jak wątroba, płuca lub guzy, są czasami trudniejsze do pełnej homogenizacji. Jednorazowe probówki o pojemności 2 ml są często zbyt małe, aby zmieścić całą objętość próbki, więc próbka musi zostać podzielona i ponownie połączona po procesie homogenizacji, co oznacza dodatkową pracę i i dłuższy czas na przeprowadzenie całego procesu. Większe naczynia mielące, wykonane na przykład ze stali nierdzewnej, mogą pomieścić całą objętość próbki, ale muszą być czyszczone po każdym użyciu. Adapter do młynka miksującego MM 400 rozwiązuje ten problem, umożliwiając użycie jednorazowych probówek 5 x 5 ml, które mają większą pojemność i nie wymagają czyszczenia. W jednej partii można homogenizować 10 próbek jednocześnie. Probówki typu Falcon o pojemności 50 ml mogą być również używane do homogenizacji próbek tkanek. W tym przypadku w czasie zaledwie kilku minut można przetworzyć jednocześnie 8 niezależnych prób.

Próbka wątroby przed i po homogenizacji w MM 400

Mielenie kriogeniczne próbek biologicznych

Niektóre próbki biologiczne, takie jak włókniste rośliny, twarde żyły, paznokcie lub niektóre tkanki zwierzęce czy nowotworowe, są trudne do homogenizacji w układzie buforowym. Są one albo zbyt miękkie, albo zbyt twarde lub zbyt włókniste, aby można je było skutecznie sproszkować w zawiesinie. Lepszą alternatywą dla tych próbek jest mielenie kriogeniczne, które obejmuje zamrażanie ich ciekłym azotem przed lub w trakcie procesu mielenia. Technika ta sprawia, że próbki stają się kruche i łatwe do rozdrobnienia na jednorodne, homogeniczne proszki. Mielenie kriogeniczne ma również tę zaletę, że zachowuje integralność np. białek lub lotnych związków, które mogą ulec degradacji lub odparowaniu w wyższych temperaturach. Co więcej, mielenie kriogeniczne może rozbijać organelle wewnątrzkomórkowe niektórych organizmów, takich jak drożdże.

W przypadku lepkich próbek, takich jak jagody, mielenie kriogeniczne jest często jedyną możliwą metodą uzyskania jednorodnej próbki. W tabeli wymieniono kilka przykładów materiałów, które zostały z powodzeniem rozdrobnione metodą mielenia kriogenicznego w młynie miksującym MM 400 lub CryoMill. Stalowe probówki o pojemności 2 ml mogą być używane do mielenia kriogenicznego w MM 400. W przypadku większych prób podobne efekty można uzyskać w młynie MM 500 control z naczyniami o pojemności do 125 ml. W przypadku pracy z ciekłym azotem należy zastosować CryoPad. We wszystkich wymienionych młynach dostępne są również tubki ze stali nierdzewnej o pojemności 2 ml i odpowiednie adaptery do mniejszych objętości próbek.

^{tubki 2 ml ze stali nierdzewnej}

Próbka	Akcesoria	Feed quantity	Czas mielenia	Szybkość	Rozdrobnienie końcowe (d90)/
E. coli bacteria	2 naczynia do mielenia ze stali nierdzewnej o pojemności 50 ml 2 kulki mielące o średnicy 25 mm ze stali nierdzewnej na naczynie	2 x 10 ml zamrożone granulki komórkowe	2 min	30 Hz	całkowite rozbicie komórek
muscle tissue	naczynie mielące 50 ml ze stali nierdzewnej kula mieląca 25 mm ze stali nierdzewnej	10 g	4 min	25 Hz	<150 µm
pine needles	2 adaptery na dziesięć fiolek o pojemności 2 ml każda 2 kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm na fiolkę		3 min	30 Hz	Powtarzalna ekstrakcja RNA z 20 próbek w jednym kroku
berries	naczynie do mielenia ze stali nierdzewnej 50 ml 4 x kulki mielące ze stali nierdzewnej o średnicy 15 mm	2 g	40 secs	20 Hz	<200 µm
finger nails	adapter na probówki 4 x 2 ml do CryoMill 4 kule 5 mm ze stali nierdzewnej na probówkę	1 paznokieć na fiolkę	2 min	25 Hz	<200 µm
rat gut	naczynie mielące 35 ml ze stali nierdzewnej 1 x kula 20 mm ze stali nierdzewnej	1.8 g	2 min	30 Hz	<150 µm

^{Kawałki mięsa przed i po mieleniu kriogenicznym}

^{Lepkie jagody
przed i po mieleniu kriogenicznym}

^{Igły sosnowe
przed i po mieleniu kriogenicznym}

^{Żel agarozowy do separacji RNA ze sproszkowanych igieł sosnowych wykazujący dobrą powtarzalność i ilość przygotowanego RNA}

Próbki kryminalistyczne

Próbki kryminalistyczne, takie jak włosy, kości i zęby, są w większości kruche i dlatego zwykle nie wymagają chłodzenia przed sproszkowaniem. Aby osiągnąć pożądany stopień rozdrobnienia analitycznego, próbki mogą być poddane wstępnemu kruszeniu w kruszarce szczękowej lub młynie tnącym w celu zmniejszenia ich wielkości cząstek do rozmiaru poniżej 10 mm w celu dalszego przetwarzania w młynie kulowym. Młyny tnące są używane do wstępnego kruszenia kości, które mogą być świeże, a zatem nie całkowicie suche, a nawet mogą zawierać resztki mięsa. RETSCH oferuje szeroką gamę młynów tnących do wstępnego rozdrabniania materiałów miękkich, średnio twardych, elastycznych, twardych i włóknistych. Szeroka gama akcesoriów pozwala na optymalne dostosowanie do różnych aplikacji. Młyn SM 300 może być wyposażony w trzy różne rotory i sita separujące o oczkach od 0,25 mm do 20 mm. W przeciwieństwie do świeżych i tłustych kości, kości suche można rozdrobnić do poziomu poniżej 0,25 mm w jednym lub dwóch krokach. SM 300 posiada regulowaną prędkość obrotową w zakresie od 100 do 3000 obrotów na minutę. Pulweryzacja kości, zębów lub włosów jest najczęściej przeprowadzana w młynach kulowych przy użyciu kul mielących > 5 mm wykonanych ze stali, tlenku cyrkonu lub węglika wolframu.

^{Próbka kości przed i po zmieleniu w młynie tnącym}

^{Ludzkie włosy przed i po drobnym zmieleniu w młynie miksującym}

Procedura płukania w celu uzyskania nienaruszonych komórek bakteryjnych z ludzkiej tkanki

Jednym z potencjalnych powikłań operacji wymiany stawu, np. łokciowego lub kolanowego, jest zakażenie otaczających tkanek przez różne bakterie. Infekcje te, zwane infekcjami stawów protetycznych (PJI), mogą wystąpić w dowolnym momencie od kilku dni do kilku lat po operacji. Są one trudne do leczenia, ponieważ mogą je wywoływać różne rodzaje bakterii, które nie zawsze są wykrywane konwencjonalnymi metodami. Dlatego konieczne jest wyizolowanie bakterii z próbek tkanek w sposób, który zachowa ich żywotność i pozwoli na ich identyfikację i hodowlę. W tym miejscu młynek miksujący MM 400 może pomóc, a wszystko dzięki prostej procedurze: Próbki są mieszane z 20 ml sterylnej demineralizowanej wody i 5 ml 1 mm szklanych kulek w sterylnym stalowym naczyniu. Można użyć jednorazowych butelek z szeroką szyjką o pojemności 30 ml. Maksymalnie 8 butelek wstrząsa się przez trzy i pół minuty z częstotliwością 30 Hz, aby usunąć bakterie z próbek bez ich niszczenia. Bakterie można następnie łatwo wyhodować na płytce agarowej w celu dalszej analizy. Metoda ta charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem wykrywalności (A.-L. Roux et. al 2010) i może być stosowana do każdej stałej zainfekowanej próbki tkanki, nawet jeśli zawiera ona wszczepiony materiał.